Распространение пищевых патогенов, таких как Salmonella, остаётся серьёзным вызовом для глобального здравоохранения. Эти микроорганизмы ежегодно вызывают миллионы инфекций, и более половины случаев пищевых интоксикаций в мире связаны именно с ними. Соответственно, своевременная диагностика имеет ключевое значение для предотвращения распространения бактерий и снижения числа инфекционных случаев. С этой целью в новом исследовании была протестирована ПЦР-методика, позволяющая обнаруживать Salmonella в пищевых продуктах менее чем за 7 часов. В настоящее время стандартные диагностические методы требуют 5 и более дней, что значительно замедляет изъятие заражённой продукции с рынка и напрямую увеличивает риск возникновения эпидемических вспышек.
Почему Salmonella представляет серьёзную угрозу?
Salmonella преимущественно обитает в кишечном тракте животных и попадает к человеку при употреблении заражённых пищевых продуктов — мяса, яиц, овощей, молока и морепродуктов.
Сальмонеллёз признан второй по распространённости зоонозной инфекцией (заболеванием, передающимся между животными или от животных человеку и наоборот) в Европейском Союзе. Согласно официальным данным за 2023 год, было зарегистрировано 77 486 случаев, что соответствует уровню заболеваемости 18 на 100 000 населения. Клинически наиболее часто выявляемые серовары — S. Enteritidis, S. Typhimurium и монофазный S. Typhimurium.
Инфекция проявляется следующими симптомами: тошнота, абдоминальная боль, рвота и диарея. Хотя большинство пациентов полностью выздоравливает, дети младше 5 лет, пожилые люди и пациенты с иммунодефицитом имеют высокий риск развития жизнеугрожающих осложнений. Плохие санитарные условия на всех этапах пищевой цепи — от фермы до конечного потребителя — способствуют бактериальному загрязнению.
Регламент ЕС (EC 2073/2005) строго требует нулевой толерантности к Salmonella в продуктах высокого риска (например, фарш, молочные продукты, готовые к употреблению овощи и моллюски). Однако действующая стандартная методика диагностики (ISO 6579-1:2017) предполагает многоэтапную процедуру, занимающую несколько дней и включающую предварительное обогащение, селективный рост, высевание и окончательное подтверждение.
Быстрый ПЦР-метод
Исследователи протестировали новую методику на листовых овощах, мясном фарше, моцарелле из буйволиного молока и моллюсках. Для тестирования использовали как низкие (1–10 КОЕ/25 г), так и высокие уровни (10–100 КОЕ/25 г) контаминации S. Typhimurium.
Экстракция бактериальной ДНК: сравнивались два недорогих и быстрых метода — простое кипячение образца и использование специализированного реагента Chelex-100. Оба метода обеспечили быструю изоляцию бактериальной ДНК.
Рост бактерий (фаза обогащения): исследователи оценили, какая культуральная среда (BPW — Буферизованная пептонная вода) лучше стимулирует рост Salmonella. Сравнивались стандартная среда и среда, усиленная специальными капсулами.
Температурный фактор: было протестировано стандартное значение температуры инкубации (37 °C) и слегка повышенное, селективное (42 °C), которое благоприятствует росту Salmonella.
Предварительное приготовление среды: исследователи значительно ускорили процесс, предварительно инкубировав среду BPW в течение ночи при 41,5 °C.
Финальный тест (qPCR): для детекции ДНК использовали набор iQ-Check, длительность анализа составила всего 70 минут.
Для обеспечения достоверности исследования все пищевые образцы были предварительно проверены и подтверждены как свободные от Salmonella.
На следующем этапе пищевые образцы смешивали со средой BPW для создания благоприятных условий роста бактерий. Эту смесь инкубировали, и исследователи брали периодические пробы с интервалами от 0 до 20 часов.
Для оценки результатов применили комплексный статистический анализ (ANOVA, t-тесты, регрессионный анализ). В основу анализа легли значения Ct (Cycle Threshold), показывающие, сколько циклов ПЦР потребовалось для обнаружения ДНК Salmonella. Чем ниже Ct-значение, тем больше бактерий содержится в образце.
Ключевые результаты: выявление менее чем за 7 часов
Исследование показало, что экстракция ДНК Salmonella методом кипячения или с помощью Chelex-100 обеспечивает результаты уже через 4–5 часов. Кроме того, Ct-значения снижались пропорционально росту количества бактерий.
Оптимальным условием оказалась стандартная среда BPW при 37 °C. Время обнаружения варьировало между различными продуктами (фарш, моцарелла, зелень) — от 4 часов (зелень, высокий уровень) до 8 часов (моллюски, низкий уровень).
Финальный оптимизированный протокол (BPW, предварительно разогретая при 41,5 °C + Chelex + qPCR) обеспечил обнаружение Salmonella в фарше, моцарелле и моллюсках на всех уровнях контаминации в течение 4 часов.
Полный рабочий цикл занимает менее 7 часов.
ПЦР-методика позволяет предотвратить эпидемические вспышки и обеспечивает возможность оперативного изъятия заражённых продуктов в тот же день. Преимущества метода обусловлены высокой степенью автоматизации лабораторий и его экономической эффективностью по сравнению с традиционными методами.
Источник: Frontiers in Microbiology
